神经生长因子促进烫伤创面释放内源性生长因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实神经生长因子促进创面组织释放内源性各类生长因子及生长因子受体，起到正性调节作用，促进修复细胞增殖，加速创面愈合，使创面愈合由以往的被动等待自愈发展到主动调控愈合。

目的：观察局部应用神经生长因子对大鼠烫伤创面转化生长因子β1和碱性成纤维细胞因子表达的影响。

方法：取24只成年SD大鼠，于背部制成深Ⅱ度烫伤创面，随机分为4组，烧伤创面清创后，分别予以两层浸湿有1，2.5，5 mg/L神经生长因子溶液及等渗盐水纱布覆盖。治疗后 3，5，9，14 d观察创面愈合时间和创面残留率，切取创面组织进行组织学观察，检测创面转化生长因子β1，碱性成纤维细胞因子的表达及细胞DNA周期的变化。

结果与结论：各治疗组创面愈合时间较对照组提前，尤以5 mg/L神经生长因子治疗组最为明显(P < 0.01)，各治疗组创面残留率较对照组明显减小；创面组织学显示治疗组真皮浅层有核细胞数较对照组明显增多；各治疗组给药时间点转化生长因子β1，碱性成纤维细胞因子表达均强于对照组，第5天和第9天表达强于第3天和第14天；各治疗组细胞在S期的百分比较对照组明显增加，其中5 mg/L神经生长因子组增加最为显著(P < 0.01)。结果显示局部应用神经生长因子可通过促进创面转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子表达，刺激细胞有丝分裂，促使细胞增殖，加速大鼠烫伤创面愈合。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 神经生长因子, 烫伤创面, 转化生长因子β1, 碱性成纤维细胞因子, 创面愈合, 大鼠, 愈合时间, 创面残余率, 细胞增殖, 细胞DNA周期

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that nerve growth factor can promote wound tissue to release all kinds of endogenous growth factors and growth factor receptors, which play a positive regulatory role. The nerve growth factor can promote cell proliferation and accelerate wound healing, thus making the wound healing developed from the passive waiting healing to active control healing.

OBJECTIVE: To investigate the effects of local application of nerve growth factor on the expressions of transforming growth factor β1 and basic fibroblast growth factor in rat burn wounds.

METHODS:Twenty-four adult Sprague Dawley rats were used in the study, and Ⅱ degree deep burn wound was made on the back of rats. Then, these rats were randomly divided into four groups. After burn wound debridement, the wounds were covered with gauzes containing 1, 2.5 and 5 μg/mL nerve growth factor solution and normal saline respectively. At 3, 5, 9 and 14 days after treatment, the wound healing time and percentage of residual wound were observed. Then, wound tissues were cut for histological examination, in order to detect the expressions of transforming growth factor β1 and basic fibroblast growth factor in wounds, as well as the cellular DNA cycle.

RESULTS AND CONCLUSION: The wound healing time in the treatment groups was shorter than that in the control group, especially in 5 ug/mL nerve growth factor treatment group (P < 0.01), and the percentage of residual wound in the treatment groups was less than that in the control group. The histological examination showed the number of nucleated cells in the superficial dermis of the treatment groups was significant increased when compared with that in the control group; the expressions of transforming growth factor β1and basic fibroblast growth factor in the treatment groups at different time points were stronger than those in the control group, and the expressions at 5 and 9 days were stronger than those at 3 and 14 days; percentage of cells in S phase of the treatment groups was significantly increased, especially in 5 mg/L nerve growth factor group (P < 0.01). The results indicate that local application of nerve growth factor can accelerate wound healing by increasing the expressions of transforming growth factor β1 and basic fibroblast growth factor, stimulating mitosis and promoting proliferation.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, nerve growth factor, burn wound, transforming growth factor β1, basic fibroblast growth factor, wound healing, rats, wound healing time, percentage of residual wound, cell proliferation, cellular DNA cycle

中图分类号:

R318

叶兰萍，武元元，曹广通. 神经生长因子促进烫伤创面释放内源性生长因子[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5204-5208.

Ye Lan-ping, Wu Yuan-yuan, Cao Guang-tong. Nerve growth factor promotes endogenous growth factor releasing from burn wounds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5204-5208.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 术后及换药后大鼠创面包扎固定良好，无坏死和感染，所有实验动物存活至取材完成，满足实验要求。 2.2 各组SD大鼠创面愈合时间 各治疗组创面愈合时间较对照组提前，对照组创面愈合时间平均为15.5 d， 5 mg/L神经生长因子治疗组创面愈合时间平均为 13.5 d，明显低于对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，1 mg/L与2.5 mg/L神经生长因子治疗组创面愈合时间分别平均为15 d和14.5 d，与对照组比较差异无显著性意义。不同时间点各神经生长因子治疗组创面残留率较对照组均减小，见表1。

2.3 各组SD大鼠创面组织学变化 在光镜下测量毛细血管的数量(个/mm²)，各时相治疗组毛细血管数量均较对照组明显增多，以5 mg/L神经生长因子治疗组最明显(P < 0.01)。治疗组不管是创面边缘的表皮细胞，还是创面残存的毛囊上皮细胞，均较对照组增生活跃，且细胞层次多，创面上皮化较对照组提前。其中以5 mg/L神经生长因子治疗组最为显著，真皮浅层有核细胞数较对照组明显增多，见图1，2。

2.4 创面组织转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子表达情况 各治疗组创面组织标本经转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子受体免疫组织化学检测，结果显示用药后第3天切片中可见有转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子表达，用药后第5天和第9天转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子表达显著。这两时间点同一浓度组之间表达结果无明显差别。同一时间点1，2.5和5 mg/L神经生长因子治疗组各标本中转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子均见有表达，但以5 mg/L神经生长因子治疗组表达最为明显， 2.5 mg/L神经生长因子治疗组略差于5 mg/L神经生长因子治疗组，1 mg/L神经生长因子治疗组最差，见图3-5。而生理盐水对照组各免疫组织化学切片上均未见表达，与治疗组相比差异有显著性意义。

2.5 各组SD大鼠创面组织细胞DNA周期变化 见表2。实验证实各治疗组在S期的百分比较对照组明显增加，其中5 mg/L神经生长因子组增加最为明显(P < 0.01)，见表2。说明局部应用神经生长因子后处于分裂增殖的细胞增多，证实神经生长因子具有刺激细胞的有丝分裂，而有利于细胞的增殖，起到加速创面愈合的作用。

参考文献

[1]Noli C, Miolo A.The mast cell in wound healing.Vet Dermatol. 2001;12(6):303-313.

[2]Shi ED, Wang BC, Sun QS. Nerve growth factor and injured peripheral nerve regeneration. Neural Negen Res. 2008; 3(11):1273-1276.

[3]李炳辉,邹新华,杨鸿,等.神经生长因子在糖尿病足创面组织中的表达[J].中华损伤与修复杂志:电子版,2010,5(5):608-612.

[4]杨敏烈,黄金井.神经生长因子的作用及其在创面修复和瘢痕形成中的意义[J].组织工程与重建外科杂志,2008,4(1):56-58.

[5]李玲巧,姜会庆,解伟光,等.神经生长因子对深Ⅱ度烫伤大鼠创面愈合的调控作用[J].中华烧伤杂志,2004,20(5):299-300.

[6]吕国忠,陈玉林,杨敏杰,等.神经生长因子调控烧伤创面的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,2000,14(5):268-270.

[7]史春梦,程天民,屈纪富,等.神经生长因子同时促进放创复合伤小鼠创面愈合和造血恢复的实验研究[J].中华放射医学与防护杂志, 2002,22(3):160-162.

[8]吕国忠,杨敏杰,顾在秋,等.神经生长因子加速猪深Ⅱ度烧伤创面愈合的实验[J].中华烧伤杂志,2001,17(1):29-31.

[9]谢沛霖,薛晓东,张冀北,等.局部应用神经生长因子联合胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面愈合及HIF-1α和VEGF表达的影响[J].中国医师杂志,2011,13(1):33-37.

[10]吴志宏,黄静,高微虹,等.鼠神经生长因子促进大张移植皮片感觉康复的临床研究[J].中华烧伤杂志,2007,23(6):440-443

[11]付小兵.参与创面愈合调控的神经因素[J].中国危重病急救医学, 2004,16(2):65-66.

[12]Martinez G, Di Giacomo C, Sorrenti V,et al.Fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 immunostaining in rat brain after cerebral postischemic reperfusion.J Neurosci Res. 2001;63(2):136-142.

[13]付小兵,王德文.现代创伤修复学[M].北京:人民军医出版社,1999: 192-198.

[14]Simone MD, De Santis S, Vigneti E,et al.Nerve growth factor: a survey of activity on immune and hematopoietic cells. Hematol Oncol. 1999;17(1):1-10.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年6月至2010年3月在兰州大学医学院动物实验室完成。

材料：

实验动物：选用纯系健康成年SD大鼠24只，体质量200-250 g，雌雄各半。

神经生长因子促进创面愈合实验所用的试剂及仪器：

实验方法：

动物模型制备：实验前动物禁食12 h，3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛，用控温控压电烫仪在 75 ℃下作用11 s，制成直径为2.5 cm的圆形深Ⅱ度烧伤创面(病理切片显示大量炎性细胞浸润，胶原纤维肿胀玻璃样变性融合坏死，部分毛囊及皮脂腺崩解，符合深Ⅱ度烫伤病理改变)。根据创面应用神经生长因子情况将24只大鼠分为等渗盐水对照组和1，2.5，5 mg/L神经生长因子治疗组，每组6只。

给药方法：烧伤创面清创后，分别予以两层浸湿有不同剂量的神经生长因子溶液及等渗盐水纱布覆盖，外敷含1%的磺胺嘧啶银冷霜纱布，再用多层无菌纱布包扎，每天以同样的方法换药1次。

观测指标：①创面残留率和创面愈合时间，创面残留率=当天创面面积/原始创面面积×100%。②病理组织学检查：于伤后3，5，9，14 d取大鼠背部创面组织，标本按双盲法编号，进行常规石蜡切片，苏木精-伊红染色，行光镜组织学观察。③免疫组织化学染色：每个标本取5张切片，在组织切片中央区及周边区随机选各5个高倍视野，采用Pareek方法计算毛细血管数目。取部分切片根据SP试剂盒说明书采用免疫组织化学染色，镜下观察转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子阳性表达情况。

判定标准：在显微镜10倍放大倍数下每组随机取10个视野分别测定阳性目标面积占总面积比例(%)，用免疫组化半定量判断指标，无表达或少量表达，染色数弱，面积小于5%者为阴性，染色面积大于5%者为阳性。④流式细胞计数仪分析创面愈合过程中细胞DNA周期的变化。

图像分析：采用MIG2000综合分析系统对切片进行图像分析，所有切片均在同一放大倍数、同一光强度下分析。各组在每个时相点每个指标检测5张切片，每张切片测量相同面积。

统计学分析：对所得数据采用SPSS 10.0统计软件进行多因素方差分析检验，组间百分率用χ²检验，组间计量比较用t 检验。

讨论

神经生长因子是一类广泛存在、具有多种生物学效应的活性因子，与组织的损伤修复密切相关^[3-6]。1999年Engin曾报道在鼠背部创面保留神经的伤区，创面愈合时间比失神经创面明显缩短^[1]。2000年Lai等报道创伤愈合过程中周围神经释放的P物质对伤口愈合有促进作用。史春梦等^[7]以小鼠复合伤模型进行创面愈合试验，结果显示神经生长因子对复合伤动物创面愈合有较好的促愈效果，并进一步证实神经生长因子可通过促进修复细胞的增殖加快创面愈合。临床中将神经生长因子应用于烧伤创面后观察到上皮增生活跃，真皮层有核细胞数明显增多的现象，证实了神经生长因子的细胞趋化作用。烧伤创面局部应用神经生长因子后可使免疫细胞趋化并释放生长因子和胶原酶等基质蛋白酶，帮助分解、清除损伤创面变性坏死的细胞及细胞胞外基质，从而为新生上皮的爬行、细胞增殖创造了良好的场所^[8]。谢沛霖等^[9]研究表明局部应用神经生长因子联合胰岛素可加速创面愈合，其机制可能通过促进创面微血管再生，纠正局部缺氧。吴志宏等^[10]局部应用鼠神经生长因子治疗中小面积烧伤和需行瘢痕整形术的成年患者，结果表明局部应用神经生长因子可加速感觉神经末梢的再生，促进移植皮片的感觉恢复。国内付小兵^[11]也报道了局部神经生长因子可加速正常伤口及糖尿病鼠伤口的愈合速度。大鼠皮肤全层损伤后，涎腺和皮肤创面、创周以及远处未损伤的皮肤神经纤维末梢释放出贮存的神经肽类物质神经生长因子等，作用于角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞等修复细胞，促使其增殖分化，合成、分泌生长因子，并表达相应的受体，以自分泌或旁分泌的形式参与创伤愈合的过程^[12]。此外，创伤时感觉神经释放的神经肽与肥大细胞受体结合，触发肥大细胞系脱颗粒，而肥大细胞释放的神经生长因子又刺激感觉神经释放神经肽，进一步放大了神经生长因子对愈合的调控作用^[13-14]，但神经生长因子促进创面愈合的机制及与其他生长因子之间的关系尚不清楚，而其对瘢痕增生的调控及信号的研究尚属空白。作者在烧伤创面应用神经生长因子后观察到，上皮增生活跃，真皮层有核细胞数明显增多，证实了神经生长因子的细胞趋化作用。另外，实验应用神经生长因子后各时相组创面残留率较对照组明显减少，而毛细血管数量各时相组则明显增多。通过对转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子含量测定结果的分析显示，在第5天创面组织转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子含量明显增多，有核细胞数也明显增多，同时新生上皮细胞的迁移、增殖十分活跃，说明烧伤创面局部应用神经生长因子通过对免疫细胞的趋化，使后者在释放生长因子的同时，释放胶原酶等有关基质蛋白酶，帮助分解、清除损伤创面变性坏死的细胞及细胞外基质成分，为新生上皮的爬行、细胞增殖创造一个良好的场所。而转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子含量在伤后明显增加，可能与应用神经生长因子后在创面愈合的早期，转化生长因子β1及碱性成纤维细胞因子的分泌增加有关，至创面愈合后期日渐升高，且超过对照组。创面组织细胞周期分析表明，创面治疗组在细胞周期的S期，其百分比较对照组明显增高，说明局部应用神经生长因子后，处于分裂增殖的细胞增多，证实了具有刺激细胞的有丝分裂而有利于细胞的增殖，起到加速创面愈合的作用。组织学的观察结果也同样显示，创面治疗组新生上皮细胞迁移与增殖十分活跃，提示有临床应用前景。

[1]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[4]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[5]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[6]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[7]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[8]	罗选翔, 经历, 潘彬, 冯虎. 甲钴胺联合鼠神经生长因子促进脊髓型颈椎病术后神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 719-722.
[9]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[10]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[11]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[12]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[15]	白胜超, 高扬, 王博, 李俊平, 王瑞元. 针刺干预大负荷运动损伤模型大鼠骨骼肌线粒体功能的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3648-3653.